Sm 11.02.07 - estudio preliminar expresion

Expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en pacientes con dependencia al alcohol Estudio preliminar de la expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en células mononucleares de sangre periférica en pacientes con dependencia al alcohol con y sin depresión mayor comórbida Enrique Becerril-Villanueva,1 Julia Moreno-Aguilar,2 Danelia Mendieta-Cabrera,2 Denia González-Cruz,2 Guillermina Natera-Rey,3 Lenin Pavón-Romero,1 María Eugenia Hernández-Gutiérrez1 peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) can be used to researchneurodegenerative, psychiatric, and alcohol dependence disorders.
The 2008 National Addiction Survey demonstrated the existence of The aim of this study was to assess 5-HTT expression levels in 39 million alcohol drinkers, of whom 4.2 million are excessive drinkers the PBMCs from alcohol-dependent patients and patients with and 4.8 million are alcohol dependents. No reports of the comorbidity comorbid alcohol-dependence and major depression disorder.
of psychiatric disorders in alcohol consumers in our country exist.
Nevertheless, 40% to 50% of alcohol-dependent patients from other countries have some sort of psychiatric disorder, such as major The Outpatient Consultative Service from the Centro de Ayuda a Alcohólicos y Familiares (CAAF) and the Centro de Alcohólicos y Serotonergic function is a key mediator of mood states, Drogadictos «Carrasco» screened 70 patients from February to impulsiveness, and addictive behavior, including alcohol November 2008. Twenty patients who met the criteria of alcohol consumption. Several studies have noted alterations in the dependence, according to the Spanish version of the Mini International serotonergic system in alcoholics (as demonstrated by an increase in Neuropsychiatric Interview (MINI), were accepted. Alcohol the shooting frequency of raphe nuclei serotonergic neurons, an dependence was based on the Alcohol Dependence Scale (EDA) that increase in serotonin levels in the accumbens nuclei, and a loss in was adapted to the Mexican population.
serotonergic neurons in the raphe nuclei) and depressed patients Healthy volunteers (n=12) were selected concurrently from the (decreases in the density of serotonin reuptake transporter [5-HTT] general population of Mexico City with the start of patient enrollment.
A psychiatrist evaluated the mental health of these patients using Clinical studies have documented that excessive alcohol intake MINI. Clinical and laboratory trials demonstrated normal standard reduces 5-HT levels and that this condition potentiates psychiatric disorders, such as anxiety, major depression, and alcohol Patients were included based on INPRFNC092318.1 research dependence. These data demonstrate an association between protocol procedures, which were approved by the Ethics Committee alcoholism, psychiatric disorders, and alcohol dependence.
of the Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente.
By molecular biology techniques, genetic risk factors have been All participants were given a detailed explanation concerning identified and candidate genes, such as 5-HTT, have been selected.
the study objectives and gave their signed informed consent.
This gene is associated with a greater susceptibility to onset of alcohol- The patients for this study were men and women, aged 18 years and older who presented a diagnosis of alcohol dependence. Patients The 5-HTT gene lies in the SLC6A4 locus of 17q11.1-q12 and were grouped as follows: Group A: diagnosed alcohol dependence encodes a 600-amino-acid integral membrane protein. This (n=12) and Group B: diagnosed alcohol dependence depressed transporter regulates serotonergic neurotransmission through removal of 5-HT from the synaptic space. Pharmacological research has shown All patients arrived to the clinical laboratory from 8:00 to 9:00 that selective reuptake inhibitors (5-HTT blockers) reduce alcohol a.m. to undergo a peripheral blood test. Blood was drawn by venous intake in alcohol-dependent and major depression patients.
puncture and placed into anticoagulant-coated tubes. The blood was Serotonergic system receptors, such as 5-HTT, 5-HT , and 5-HT then diluted in an isotonic saline solution (SSI) (1:1, v/v) and transferred are expressed in nervous system and immune system cells; thus it is to a tube that contained Ficoll-Histopaque solution (1:2, v/v) to form a likely that both systems have functional similarities. Due to this property, density gradient. The sample was centrifuged at 1600 rpm for 30 minutes Laboratorio de Psicoinmunología de la Dirección de Investigaciones en Neurociencias, Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente, INPRF.
Dirección de Servicios Clínicos, INPRF.
Dirección de Investigaciones Epidemiológicas y Psicosociales, INPRF.
Correspondencia: Dra. María Eugenia Hernández-Gutiérrez. Laboratorio de Psicoinmunología. Dirección de Investigaciones en Neurociencias. InstitutoNacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente. Calzada México-Xochimilco 101, San Lorenzo Huipulco, Tlalpan, 14370, México DF. Tel: 4160 5083 Fax:5655 9980. E-mail: droso200@imp.edu.mx Recibido primera revisión: 28 de julio de 2010. Segunda versión: 27 de octubre de 2010. Tercera versión: 21 de enero de 2011. Aceptado: 2 defebrero de 2011.
at 4°C. The gradient interphase, which contained the mononuclear cells, Key words: Alcohol-dependent, major depressive disorder, 5-TT, was collected, SSI cells were washed, and Trizol was added.
RNA extraction from the PBMCs was performed using Trizol, wherein a monophase phenol solution and guanidine isothiocyanate wereused to lyse cells and dividing the sample into 2 phases: aqueous La Encuesta Nacional de Adicciones 2008 reportó que en México and organic. The aqueous phase was separated with chloroform, existen 39 millones de personas que consumen alcohol y 4.8 millo- and RNA was precipitated with isopropanol. Genetic material was nes presentan dependencia. A nivel mundial varios estudios indican washed with alcohol and allowed to dry. RNA was resuspended with que los pacientes con dependencia al alcohol (40 a 50%) presentan RNase- and DNase-free water. The index of purity of the RNA samples comorbilidad con algún tipo de padecimiento psiquiátrico.
La función serotoninérgica es un mediador clave en los estados RNA samples were treated with DNase 1 (Invitrogen Life de ánimo, la impulsividad y las conductas adictivas, entre ellas el Technologies, CA, USA) to eliminate DNA contamination. Total RNA consumo de alcohol. Se ha reportado que el consumo excesivo de was used for the generation of cDNA and was performed from 1 μg alcohol etílico disminuye los niveles de serotonina, aumenta la of total RNA in a reaction volume of 20 μL containing 5X Buffer 5μL frecuencia de disparo de las neuronas serotoninérgicas en el núcleo Retro-Transcriptase (Promega, WI, USA), 15 mM MgCl , 1.25 ul 10 del rafé y aumenta los niveles de serotonina en el núcleo accumbens.
mM dNTP mix (Promega, WI, USA), 200 U M-MLV reverse Las técnicas de biología molecular han permitido identificar transcriptase (Promega, WI, USA) and 1 μL of 10 mM OligodT (GE, factores de riesgo genético y se han seleccionado genes candidatos UK). The reaction mixture was incubated for 60 minutes at 42ºC in a del sistema serotoninérgico, siendo uno de ellos el gen para el thermocycler (Thermocycler Gradient, Eppendorf, Germany) and transportador de serotonina (5-HTT), el cual se ha demostrado que applied a final cycle of 90°C for 5 minutes.
se encuentra asociado tanto a una mayor susceptibilidad para el The reverse-transcribed product (cDNA) was amplified by PCR establecimiento de la dependencia al alcohol como a la depresión in a final reaction volume of 25 μL containing 2 μL of cDNA, 1 mM deoxyribonucleotide dNTP Mix (Promega, WI, USA), 0.75 mM MgCl , Los receptores del sistema serotoninérgico como el 5-HTT, el 2.5 mM oligonucleotide GoTaq and 1.25 units DNA polymerase (Prome- 5-HT y el 5-HT se expresan tanto en las células del Sistema Nervioso ga, WI, USA). PCR was performed for 25 cycles, using a cycling program como en las células del sistema inmunológico, lo que sugiere una of 94°C for 1 minute, 60°C for 1 minute and 72°C for 1.30 minutes in similitud funcional de ambos sistemas. Es por ello que las células a thermocycler for the amplification of 5-HTT and GAPDH. The oligo- mononucleares de sangre periférica (PBMC) han sido utilizadas como nucleotides used for 5-HTT were: sense 5'-GAACTCCTGGAACAC un modelo de estudio en los trastornos de dependencia al alcohol y TGGCAAC-3' and antisense 5'-ATGACAAATCCCGAAACGAAGC-3' (534 base pairs, [bp] product). In the case of GAPDH sequences of El objetivo de este estudio fue evaluar los niveles de expresión del oligonucleotides used were: sense 5'-TGGGGAAGGTGAAGGTC gen 5-HTT en células mononucleares de sangre periférica de pacientes GGAGTC-3' and antisense 5'-GACTTCAACAGCGACACCCACTC-3' con dependencia al alcohol con y sin depresión mayor comórbida.
(874 bp product). The amplicons were separated on an agarose gel En el Servicio de Consulta Externa del Centro de Ayuda a and stained with ethidium bromide. The bands were analyzed by Alcohólicos y Familiares (CAAF) y en el Centro de Alcohólicos y computerized densitometry. The optical density values for 5-HTT were Drogadictos «Carrasco» se evaluaron 70 pacientes durante el periodo calculated as the quotient between the values for 5-HTT and GADPH, comprendido entre febrero y noviembre de 2008. De entre éstos se expressed as the mean ± standard deviation.
incluyeron 24 que cumplieron con los criterios diagnósticos para la Statistic analysis was performed using the Shapiro-Wilk dependencia al alcohol de acuerdo al DSM-IV por medio de la entrevista homogeneity test and nonparametric Mann-Whitney test. Differences estructurada Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) en su were considered statistically significant when p≤0.05.
versión en español. Cumplieron además con los siguientes criterios deinclusión: a) Que fueran pacientes de nuevo ingreso, b) Mayores de 18 años, c) De sexo femenino o masculino, d) Libres de tratamiento 5-HTT levels were nondetectable (ND) in patient with comorbid alcohol- farmacológico tres semanas antes de incluirlos al estudio y e) Firmar dependence and major depressive disorder. By Shapiro Wilk test, healthy carta de consentimiento informado para participar en el estudio.
volunteers and alcohol-dependent patients did not differ. Healthy Se incluyeron para comparación voluntarios sanos (n=12) los volunteers expressed higher levels of 5-HTT gene (0.5012 ± 0.1349) cuales fueron seleccionados de la población abierta de la Ciudad compared with alcohol-dependent patients (0.3150 ± 0.1836) de México en el periodo de febrero a noviembre de 2008 y que cumplieran con los siguientes criterios: a) No tener algún diagnósticopsiquiátrico, para lo cual se aplicó el MINI, b) Mayores de 18 años, c) Sexo femenino o masculino, d) Libres de tratamiento farmacológico Our PCR method allowed us to determine that 5-HTT expression is tres semanas antes de incluirlos en el estudio y e) Firmar carta de lower in the two groups of patients compared with healthy volunteers.
consentimiento informado para participar en el estudio.
These results are consistent with studies that have reported that 5-HTT Todos los participantes asistieron de 8:00 hs. a 9:00 hs. al expression declines in lymphocytes from major depression disorder laboratorio clínico del Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la patients compared with healthy volunteers. The lack of detection of 5- Fuente para la obtención de la muestra de sangre periférica de la HTT in alcohol- dependence depressed patients suggests that this cual se obtuvieron las PBMC. Se realizó la extracción del material comorbidity leads to alterations in the expression of this 5-HTT.
genético (RNA) de las muestras de PBMC con el reactivo de Trizol®.
Finally, our work is the first preliminary study that characterizes 5-HTT expression in the Mexican population, comparing alcohol dependence patients and patients with comorbid alcohol-dependence Las muestras de RNA fueron tratadas con DNasa 1 (Invitrogen Life Technologies; CA, USA) para eliminar la contaminación con DNA. La Expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en pacientes con dependencia al alcohol síntesis de cDNA (DNA copia) fue equivalente para todos los casos y C-3´) con un peso de 874 pb. Los productos de amplificación se se realizó a partir de 1 μg de RNA total en un volumen de reacción de separaron en geles de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de 20μL que contenía 5μL de Buffer 5x para Retro-Transcriptasa (Promega; etidio. El análisis se realizó por densitometría computarizada WI, USA), 15 mM de MgCl , 1.25 μl 10 mM de la mezcla dNTP (Promega; WI, USA), 200 U M-MLV transcriptasa reversa (Promega; Los voluntarios sanos presentaron una mayor expresión del gen WI, USA) y 1 μL de 10 mM OligodT (GE, UK). La mezcla de reacción (0.5012±0.1349) comparados con los pacientes con dependencia se incubó durante 60 minutos a 42ºC en un termociclador (Gradient al alcohol (0.3150±0.1836), esta diferencia fue significativa Thermocycler; Eppendorf, Germany) y se aplicó un ciclo final de 90ºC (p<0.0036, Mann-Whitney). Los niveles de expresión del gen 5-HTT para los pacientes con dependencia al alcohol con depresión mayor La amplificación para el 5-HTT se realizó en un volumen final comórbida fueron significativamente reducidos (no detectables).
de reacción de 25 μL que contenía 2 μL de cDNA, 1 mM de Con la técnica del PCR se determinó que la expresión del gen desoxiribonucleotidos Mix dNTP (Promega; WI, USA), 0.75 mM de 5-HTT está disminuida en los dos grupos de pacientes comparados MgCl 2.5 mM de oligonucleótidos y 1.25 unidades de GoTaq DNA con los voluntarios sanos. Estos resultados coinciden con los estudios Polimerasa (Promega; WI, USA) con una fase de desnaturalización que han reportado que la expresión del gen 5-HTT en linfocitos de de 94°C/1 minuto, una fase de alineación de 60°C/1 minuto y una pacientes con trastorno depresivo mayor es menor comparada con fase de extensión de 72°C/1.30 minutos, durante 35 ciclos.
los sujetos sanos. La no detección del mensaje genético del 5-HTT Los oligonucleótidos utilizados para el 5-HTT fueron los en los pacientes dependientes al alcohol con depresión mayor siguientes: sentido (5´-GAACTCCTGGAACACTGGCAAC-3´) y el comórbida sugiere que la comorbilidad puede potenciar la reducción antisentido (5´- ATGACAAATCCCGAAACGAAGC-3’) con un peso de 534 pares de bases (pb). En el caso del GAPDH las secuencias deoligonucléotidos utilizadas fueron: sentido (5´-TGGGGAAGGTGAAGG Palabras clave: Dependencia al alcohol, depresión mayor, 5-HTT, TCGGAGTC-3´) y antisentido (5´-GACTTCAACAGCGACACCCACT se proyectan hacia la corteza, el hipocampo y las estructu-ras subcorticales, de tal manera que su función en el com- La Organización Mundial de la Salud (OMS) define al alco- portamiento del consumo de alcohol puede ser de manera holismo con el término «síndrome de dependencia al alco- directa, modulando los efectos de reforzamiento, o indi- hol (SDA)» y lo describe como un trastorno de conducta recta, como mediador en el control de los impulsos y del crónico, manifestado por un estado psíquico y físico que conduce compulsivamente a la ingesta excesiva de alcohol.1 Varios estudios reportan anormalidades en el siste- El alcohol etílico es la sustancia psicoactiva de mayor con- ma serotoninérgico de los pacientes con dependencia al sumo y su dependencia está asociada de manera directa o alcohol y depresión mayor sin comorbilidad. Los pacien- indirecta con las diez principales causas de mortalidad en la tes dependientes al alcohol presentan un aumento en la población general.2 La Encuesta Nacional de Adicciones 2008 frecuencia de disparo de las neuronas serotoninérgicas reportó que en México existen 39 millones de personas que del núcleo del rafé, un aumento en los niveles de consumen alcohol, de las cuales 4.2 millones presentan abu- serotonina (5-HT) en el núcleo accumbens, unión del alco- so en su ingesta y 4.8 millones muestran dependencia.3 Ac- hol con los receptores serotoninérgicos y pérdida de tualmente, en nuestro país no existen estudios epidemio- neuronas serotoninérgicas en el núcleo del rafé en pacien- lógicos sobre los individuos que consumen alcohol con tras- tes dependientes al alcohol con consumo crónico.6-8 Ade- torno psiquiátrico comórbido, sin embargo en otros países más, se ha observado que los individuos con un consu- se ha reportado que un 40 a 50% de los pacientes con depen- mo excesivo del alcohol presentan una disminución de la dencia al alcohol presentan algún padecimiento psiquiátri- 5-HT y esta condición participa en el establecimiento de trastornos psiquiátricos como la ansiedad, la depresión Estos datos indican una relación entre la dependencia mayor y el desarrollo de la dependencia al alcohol.9,10 Por al alcohol y los trastornos psiquiátricos, de tal manera que otra parte, en los pacientes con trastorno depresivo ma- estos pacientes comórbidos constituyen una parte compleja yor se ha observado una disminución en la concentra- de la población y representan un problema de salud priori- ción de la 5-HT así como una disminución en la densidad tario. Por esto se requieren investigaciones neurobiológicas del transportador de recaptura de la serotonina (5-HTT) que permitan conocer los mecanismos que subyacen al esta- en el SNC, lo que conduce a un déficit en la blecimiento y mantenimiento de estos trastornos.
neurotransmisión serotoninérgica.11 Finalmente, estudios El sistema serotoninérgico del Sistema Nervioso Cen- clínicos en pacientes con dependencia al alcohol con de- tral (SNC) es un mediador fundamental en los estados del presión mayor comórbida detectaron una disminución en ánimo, la impulsividad y las conductas adictivas, incluido los niveles del catabolito de la 5-HT (ácido 5-hidroxi- el consumo de alcohol. Su importancia se debe a que las indolacético [5-HIIA]), en el líquido cefalorraquídeo, lo cual vías serotoninérgicas procedentes de los núcleos del rafé indica una disfunción serotoninérgica.12,13 El diagnóstico doble de dependencia al alcohol y tras- servados en la sinapsis inmune, o la espina dendrítica en la torno depresivo mayor es una entidad con una etiología sinapsis neuronal). La concentración de estos intermedia- multifactorial donde convergen factores biológicos, rios de la señalización y su jerarquía temporal produce un psicosociales y ambientales.14 Con respecto a los factores efecto amplificador de la señal.5,30,31 Además, los linfocitos biológicos, los estudios familiares utilizados para evaluar la expresan receptores para varios neurotransmisores consi- contribución de los factores genéticos en la etiología de la derados como pertenecientes únicamente a las neuronas, dependencia al alcohol y de la depresión mayor15 han deter- entre ellos los del sistema serotoninérgico.32 Al respecto, Faraj minado un porcentaje de heredabilidad (proporción de las et al. han reportado que los linfocitos de pacientes con de- variaciones en el fenotipo debidas a los genes y expresada pendencia al alcohol recuperados y con periodos prolonga- en porcentaje) para el abuso del alcohol de un 50 a 60%16,17 y dos de abstinencia presentan una mayor captura de para la depresión mayor de un 40%.18 Sin embargo cabe se- serotonina y que este evento es independiente del periodo ñalar que esta susceptibilidad genética requiere, para la de abstinencia, sugiriendo un rasgo hereditario más que el manifestación de ambas enfermedades, de condiciones am- abuso crónico del alcohol.33 Adicionalmente, Rausch et al.
bientales favorables y de una exposición precisa.19,20 determinaron una mayor captura de serotonina en sujetos Los estudios de genética y las técnicas de biología con historia familiar de dependencia al alcohol (padres al- molecular han permitido identificar genes candidatos como cohólicos) versus sujetos sin historia familiar de dependen- factores de riesgo o susceptibilidad para desarrollar la de- cia al alcohol; este hallazgo podría indicar un factor biológi- pendencia al alcohol y la depresión mayor; uno de estos co asociado al riesgo en el consumo de alcohol.34 genes es el que codifica para el transportador de recaptura Con base en las evidencias anteriores el linfocito ya se propone como un modelo periférico para el estudio del sis- El gen del 5-HTT está ubicado en el locus SLC6A4 del tema serotoninérgico de varias enfermedades de tipo psi- cromosoma 17q11.1-q12 y su expresión da como resultado quiátrico como la depresión mayor y la dependencia al al- una proteína integral de membrana de 600 aminoácidos.
cohol. El objetivo de nuestro estudio fue evaluar los nive- Este transportador regula la neurotransmisión les del gen 5-HTT en células mononucleares de sangre serotoninérgica a través de la remoción de la 5-HT del es- periférica, en pacientes con dependencia al alcohol con y pacio sináptico. Estudios clínicos en pacientes con depen- sin depresión mayor comórbida, como una primera aproxi- dencia al alcohol y depresión mayor reportan una dismi- mación para la determinación de la existencia o no de una nución en la densidad y funcionalidad en el 5-HTT.21 Por expresión anómala del 5-HTT en este tipo de pacientes en otra parte, estudios realizados en modelos animales tipo «knockouts» para el transportador 5-HTT revelan que lapérdida de la función del gen 5-HTT altera los efectosneurales y conductuales inducidos por el alcohol.22 La administración de inhibidores selectivos de la recaptura de serotonina (ISRS, bloqueadores del 5-HTT) a pacientes con dependencia al alcohol, de ingesta intensa, y apacientes con dependencia al alcohol y trastorno depresivo El estudio fue un procedimiento analítico, observacional mayor comórbido inducen una reducción en el consumo de alcohol.23-28 Estas evidencias indican que el 5-HTT presentauna reducción anormal que conlleva a un déficit en la trans- misión serotoninérgica en el SNC. Sin embargo este trans- portador y otros receptores del sistema serotoninérgico tam-bién se expresan en varios tejidos a nivel periférico, lo que En el Servicio de Consulta Externa del Centro de Ayuda al puede ser útil para el estudio de la expresión del gen 5-HTT Alcohólico y a sus Familiares (CAAF) y el Centro de Alco- en los pacientes con tratamiento farmacológico. Se ha de- hólicos y Drogadictos «Carrasco» se evaluaron 70 pacien- mostrado que el 5-HTT tiene una secuencia de aminoácidos tes durante el periodo que va de febrero a noviembre de idéntica y una misma sensibilidad farmacológica en el teji- 2008. De entre éstos se incluyeron 24 que cumplieron con do cerebral y en los linfocitos.5,29 Además se han reportado los criterios diagnósticos para la dependencia al alcohol de analogías estructurales y funcionales entre las neuronas y acuerdo al DSM-IV por medio de la entrevista estructurada los linfocitos. En ambos casos, los procesos de activación, Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) en transmisión de señales y terminación de las sinapsis neuronal e inmunológica están regulados en el espacio y en el tiem- Los pacientes cumplieron con los siguientes criterios po. La regulación espacial se debe a la estabilización de las de inclusión: a) Que fueran pacientes de nuevo ingreso, moléculas implicadas en la señalización celular en localiza- b) Mayores de 18 años, c) De sexo femenino o masculino, ciones específicas (por ejemplo, los anillos concéntricos ob- d) Libres de tratamiento farmacológico tres semanas an- Expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en pacientes con dependencia al alcohol tes de incluirlos al estudio y e) Firmar la carta de consenti- de Dependencia al Alcohol (EDA) para medir el nivel de miento informado para participar en el estudio.
Los pacientes se agruparon de acuerdo a su diagnósti- Los participantes asistieron de 8:00 hs. a 9:00 hs. al la- co en pacientes con dependencia al alcohol con depresión boratorio clínico del Instituto Nacional de Psiquiatría Ra- mayor comórbida (n=12) y sin ella (n=12).
món de la Fuente para la obtención de la muestra de san-gre periférica.
Se incluyeron voluntarios sanos (n=12) los cuales fueron seleccionados de la población abierta de la Ciudad de Méxi-co en el periodo comprendido entre febrero y noviembre de La muestra de sangre periférica de los participantes se co- 2008, que cumplieran con los siguientes criterios: a) No te- lectó en tubos con anticoagulante (Vacutainer- ner algún diagnóstico psiquiátrico, basándose en la aplica- Becton&Dickinson; NJ, USA) por punción venosa en el ción del MINI, b) Mayores de 18 años, c) Sexo femenino o horario de 8:00 hs. a 9:00 hs. La sangre (5mL) se diluyó con masculino, d) Libres de tratamiento farmacológico tres se- solución salina isotónica (SSI) (1:1, v/v) y se depositó en manas antes de incluirlos en el estudio y e) Firmar la carta un tubo con una solución de Ficoll-Histopaque (1:2, v/v) de consentimiento informado para participar en el estudio.
(Sigma-Aldrich; St Louis, USA) para formar un gradientede densidad. La muestra se centrifugó a 1600 rpm durante 30 minutos a 4°C y se aislaron las células mononuclearesde la interfase del gradiente. Finalmente las PBMC se lava- A todos los participantes, tanto pacientes como voluntarios ron con SSI y se les adicionó el reactivo de Trizol®.
sanos, que cumplieron con los criterios de inclusión, se les explicó la naturaleza del estudio y se les invitó a participar.
Si estuvieron de acuerdo firmaron la carta de consentimien- La extracción del ácido ribonucleico (RNA, por sus siglas to informado. La captación de pacientes se realizó de acuer- en inglés) total fue aislado de las PBMC de los voluntarios do a los procedimientos del protocolo de investigación sanos y pacientes con el reactivo de Trizol® (Invitrogen INPRFNC092318.1 aprobado por el Comité de Ética del Ins- Life Technologies; CA, USA). Se utilizó una solución tituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñiz.
monofásica de fenol e isotiocinato de guanidina para la lisis Los pacientes y los voluntarios sanos fueron evalua- de las células y la separación de la muestra en dos fases dos con la escala MINI. Los pacientes se agruparon de (acuosa y orgánica). Después se adicionaron 200 μL de clo- acuerdo a su diagnóstico en pacientes con dependencia al roformo y se centrifugó 10000 rpm por 10 min a 4ºC para alcohol con depresión mayor comórbida (n=12) y sin ella separar la fase acuosa. La precipitación del RNA se realizó (n=12). Todos los pacientes fueron evaluados con la Escala con isopropanol y el material genético se lavó con alcoholal 75%. Finalmente la muestra se dejó secar durante cinco Cuadro 1. Datos demográficos de los participantes minutos a temperatura ambiente y se resuspendió con agualibre de RNasas y DNasas (Gibco; NY, USA). La cantidad y calidad del RNA obtenido se determinó con un espectrofotómetro (BioPhotometer; Eppendorf, Germany) en un rango de 260-280 nm y se almacenó a -80°C. El índi- ce de pureza de las muestras de RNA fue de 1.8 y 2.0.37 Obtención de la expresión del gen GADPH y 5-HTT La enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa(GADPH), al ser una enzima indispensable para la respi- ración celular, su expresión es constitutiva y ha sido selec- cionada la expresión de su gen como un control endógeno (gen constitutivo o gen de normalización) para las técnicas de biología molecular como el RT-PCR porque se ha de- mostrado que mantiene un nivel de expresión constante, aun en diferentes estados fisiológicos de la célula y en res- puesta a los tratamientos experimentales.38,39 Los valores son presentados como la media aritmética ± desviación estándar.
La educación se refiere al número de años de escolaridad. Consumo dealcohol se refiere al nivel de dependencia de acuerdo a la Escala de Depen- Las muestras de RNA fueron tratadas con DNasa 1 dencia al Alcohol.
DM = Depresión mayor; IMC=índice de masa corporal; NA=no aplica.
(Invitrogen Life Technologies; CA, USA) para eliminar la contaminación con DNA (Huang Z, 1996). La síntesis de pacientes mostraron anormalidades en sus eritrocitos (ta- cDNA (DNA copia) fue equivalente para todos los casos y maño y forma) así como en el contenido de hemoglobina.
se realizó a partir de 1 μg de RNA total en un volumen de Asimismo, en el grupo de dependencia al alcohol se detec- reacción de 20μL que contenía 5μL de Buffer 5x para Retro- taron dos pacientes, uno con consumo moderado y otro con Transcriptasa (Promega; WI, USA), 15 mM de MgCl2, 1.25 μl consumo intenso asociado a plaquetopenia. En el grupo de 10 mM de la mezcla dNTP (Promega; WI, USA), 200 U M- dependencia al alcohol con depresión mayor comórbida se MLV transcriptasa reversa (Promega; WI, USA) y 1 μL de detectaron dos pacientes con anormalidades hematológicas, 10 mM OligodT (GE, UK). La mezcla de reacción se incubó ambos con un consumo sustancial de alcohol; el primero de durante 60 minutos a 42ºC en un termociclador (Gradient ellos presentó trombocitosis y el segundo anemia microcítica- Thermocycler; Eppendorf, Germany) y se aplicó un ciclo hipocrómica, trombocitopenia y monocitosis.
Los pacientes con alteraciones hematológicas recibie- La amplificación para el 5-HTT se realizó en un volu- ron la recomendación de asistir a una consulta médica espe- men final de reacción de 25 μL que contenía 2 μL de cDNA, cializada. Estos hallazgos clínicos detectados en los eritrocitos 1 mM de desoxiribonucleótidos Mix dNTP (Promega; WI, no interfirieron con la evaluación de la expresión del men- USA), 0.75 mM de MgCl2, 2.5 mM de oligonucleótidos y saje genético porque a) los eritrocitos no contienen núcleo y 1.25 unidades de GoTaq DNA Polimerasa (Promega; WI, b) sólo se utilizaron células mononucleares (PBMC).42 USA) con una fase de desnaturalización de 94°C/1 minu-tos, una fase de alineación de 60°C/1 minuto y una fase de extensión de 72°C/1.30 minutos, durante 35 ciclos.40 Los oligonucleótidos utilizados para el 5-HTT fueron los Los pacientes con dependencia al alcohol y depresión ma- siguientes: sentido (5´-GAACTCCTGGAACACTGGCAAC- yor comórbida presentaron niveles de expresión del gen 5- 3´) y el antisentido (5´- ATGACAAATCCCGAAACGAAGC- HTT disminuidos de manera significativa y se reportaron 3’) con un peso de 534 pares de bases (pb).41 En el caso del como No Detectado (ND). La prueba de homogeneidad de GAPDH las secuencias de oligonucléotidos utilizadas fue- Shapiro Wilks no fue significativa para la expresión del ron: sentido (5´-TGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3´) y gen 5-HTT en las poblaciones de los voluntarios sanos y antisentido (5´-GACTTCAACAGCGACACCCACTC-3´) con los pacientes con dependencia al alcohol. Los voluntarios un peso de 874 pb. Los productos de amplificación se sepa- sanos presentaron una mayor expresión del gen 5-HTT raron en geles de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de (0.5012±0.1349) comparados con los pacientes con depen- etidio. El análisis se realizó por densitometría computarizada dencia al alcohol (0.3150±0.1836) y esta diferencia fue sig- nificativa (p<0.0036, Mann-Whitney) (figura 1).
Los valores de expresión del gen 5-HTT fueron obtenidoscon la siguiente fórmula: El alcohol produce alteraciones en el sistema hematopoyético e induce una agranulocitosis tóxica que conlleva a cuadros de anemia, leucopenia y trombocitopenia, disminuyendo laagregación plaquetaria.42 Las pruebas de biometría hemática Y fueron expresados como la media aritmética. Los da- de algunos pacientes mostraron índices de trombocitopenia tos de los voluntarios sanos y los de los pacientes fueron y plaquetopenia; sin embargo estas anormalidades no afec- analizados con la prueba de homogeneidad de Shapiro-Wilk.
taron la cantidad y calidad de la muestra de RNA porque la Se aplicó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para extracción se realizó a partir de las PBMC.
obtener las diferencias en la expresión del gen 5-HTT entre La técnica del RT-PCR nos permitió determinar que la voluntarios sanos y pacientes. Los análisis se realizaron con expresión del gen 5-HTT está disminuida en los dos gru- el programa estadístico Graph Pad 5.0 (San Diego, CA, USA).
pos de pacientes comparados con los voluntarios sanos.
Las diferencias fueron consideradas estadísticamente signi- Los pacientes con dependencia al alcohol mostraron una ficativas cuando la probabilidad del error tipo I fue p≤0.05.
disminución en los niveles de expresión del gen 5-HTT. Ala fecha no existe ningún estudio con el que podamos com- parar este hallazgo. Sin embargo, a partir de la hipótesisde que las neuronas comparten una gran similitud funcio- nal con las células de la respuesta inmunológica, y que el5-HTT tanto en cerebro como en los linfocitos presenta una Los voluntarios sanos presentaron valores de biometría secuencia de aminoácidos idéntica y una misma sensibili- hemática dentro de los rangos de referencia normales. Los dad farmacológica, podríamos sugerir que los estudios Expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en pacientes con dependencia al alcohol mediante tomografía por emisión de fotón único (SPECT, Una valoración indirecta de la densidad y funcionalidad por sus siglas en inglés) en pacientes alcohólicos que re- del 5-HTT proviene de los estudios de captura de serotonina portan una reducción significativa del 5-HTT en el tallo marcada radioactivamente. En estas cuantificaciones se es- cerebral, comparado con sujetos sanos y nuestros resulta- tablece la constante de disociación (Kd) y la velocidad máxi- dos en linfocitos podrían ser una aproximación similar al ma (Vmax) de la unión ligando-receptor (serotonina- trans- portador 5-HTT). En relación con este tipo de estudios, Faraj Por otra parte, en los pacientes con dependencia al al- et al. reportan que los pacientes alcohólicos, recuperados y cohol y depresión mayor comórbida la expresión del gen con periodos de abstinencia, presentan mayor captura de 5-HTT fue significativamente menor comparada con los serotonina, lo cual podría sugerir un aumento en la densi- otros grupos. Nuestros resultados coinciden parcialmente dad del 5-HTT.33 Por otra parte, en el estudio de Javors et al.
con los estudios que muestran una expresión disminuida se seleccionaron pacientes que cumplieron con el criterio de del gen 5-HTT en pacientes con trastorno depresivo mayor dependencia al alcohol pero realizaron una selección por subcategorías que se basó en consumidores tempranos ≤ 25 La coincidencia parcial de nuestros resultados en los años y consumidores tardíos ≥ 25 años y observaron una pacientes con dependencia al alcohol se debe a que los es- mayor captura de serotonina ([3H]-5-HT) en los consumi- tudios de otros grupos de investigación se han enfocado a dores tempranos versus los consumidores tardíos, lo cual identificar las variaciones alélicas en el polimorfismo fun- indicaría que los criterios de selección de los pacientes con cional del gen 5-HTT (5-HTTTLPR).45-47 Cabe señalar que dependencia al alcohol deben estar bien delimitados para los resultados de estos reportes no son concluyentes pro- interpretar correctamente los resultados.49 Dado que estos bablemente por las características demográficas de las po- datos de captura indican una disminución del 5-HTT es po- blaciones de estudio (sexo, edad, grupo étnico, subtipos de sible suponer que nuestros datos del 5-HTT en los pacientes dependencia al alcohol y comorbilidad con otras adicciones con dependencia al alcohol coinciden con lo reportado por Figura 1. La expresión del gen 5-HTT y GAPDH se obtuvo por RT-PCR de PBMC de voluntariossanos, pacientes con dependencia al alcohol y pacientes con dependencia al alcohol y depre-sión mayor comórbida. (A) Imagen de un gel con BrEt donde se observa la separación electro-forética de los amplificados obtenidos mediante RT-PCR. La banda correspondiente al GAPDHfue la referencia semicuantitativa para obtener los valores de densidad óptica del 5-HTT. Laimagen es representativa de dos cuantificaciones independientes. (B) Representación gráfica dela densitometría de las bandas de PCR. En todos los grupos, la línea horizontal representa lamedia aritmética de los datos.
*p<0.05 vs voluntarios sanos (Mann-Whitney).
5-HTT = transportador de recaptura de serotonina; GAPDH= gliceraldehído 3-fosfato deshi-drogenasa; RT-PCR=Reverso Transcripción-Reacción en Cadena de la Polimerasa; PBMC= cé-lulas mononucleares de sangre periférica; VS=voluntarios sanos; PA=pacientes con dependen-cia al alcohol; PAD=pacientes con dependencia al alcohol y depresión mayor comórbida;BrEt=bromuro de etidio; ND=No detectado; D.O.=densidad óptica.
8. Johnson BA. Role of the serotonergic system in the neurobiology of al- coholism: implications for treatment. CNS Drugs 2004;18:1105-1118.
9. Naranjo CA, Chu AY, Tremblay LK. Neurodevelopmental liabilities in Los pacientes con dependencia al alcohol con y sin depre- alcohol dependence: central serotonin and dopamine dysfunction. Neu- sión mayor comórbida presentan una disminución en la transcripción del 5-HTT, así que la expresión mínima del 10. Pivac N, Muck-Seler D, Mustapic M, Nenadic-Sviglin K et al. Platelet mensaje genético del 5-HTT detectado en nuestros pacien- serotonin concentration in alcoholic subjects. Life Sci 2004;76:521-531.
tes con dependencia al alcohol y depresión mayor comórbida 11. Nemeroff CB, Owens MJ. Treatment of mood disorders. Nat Neurosci sugiere que esta asociación puede inducir una mayor reduc- 12. Roy A, Bissette G, Nemeroff CB, DeJong J et al Cerebrospinal fluid thyro- ción en la transcripción del gen 5-HTT y dar como resultado tropin-releasing hormone concentrations in alcoholics and normal con- niveles mínimos de expresión del gen 5-HTT.
trols. Biol Psychiatry 1990;28:767-772.
Nuestro estudio se realizó con un número reducido de 13. Williams W, Reimold M, Kerich M, Hommer D et al Glucose utilization in the medial prefrontal cortex correlates with serotonin turnover rate voluntarios sanos y pacientes, por lo que nuestros datos son and clinical depression in alcoholics. Psychiatry Res 2004;132:219-224.
preliminares y no se pueden extrapolar directamente para 14. Uher R, McGuffin P. The moderation by the serotonin transporter gene determinar el significado biológico del déficit en la expre- of environmental adversity in the aetiology of mental illness: review sión del gen 5-HTT en la patofisiología de los pacientes con and methodological analysis. Mol Psychiatry 2008;13:131-146.
dependencia al alcohol con y sin depresión mayor comórbida.
15. Moussas G, Christodoulou C, Douzenis A. A short review on the aetio- logy and pathophysiology of alcoholism. Ann Gen Psychiatry 2009;8:10.
16. Ehlers CL, Gizer IR, Vieten C, Gilder A et al Age at regular drinking, clinical course, and heritability of alcohol dependence in the San Fran- cisco family study: a gender analysis. Am J Addict 2010;19:101-110.
17. Stacey D, Clarke TK, Schumann G. The genetics of alcoholism. Curr El trabajo fue realizado con el financiamiento del ICyTDF (2007) y del INPRF proyecto NC092318.1. Agradecemos al ingeniero José 18. Wurtman RJ. Genes, stress, and depression. Metabolism 2005;54:16-19.
Francisco Cortés Sotres, Jefe de Apoyo Académico, su asesoría para 19. Kuzelova H, Ptacek R, Macek M. The serotonin transporter gene (5-HTT) variant and psychiatric disorders: review of current literature. NeuroEndocrinol Lett 2010;31:4-10.
20. Teicher MH, Andersen SL, Polcari A, Anderson CM et al. The neurobio- logical consequences of early stress and childhood maltreatment. Neu-rosci Biobehav Rev 2003;27:33-44.
21. Hariri AR, Holmes A. Genetics of emotional regulation: the role of the Receptor de Serotonina tipo 2; 5-HTT: Transportador de Serotonina; serotonin transporter in neural function. Trends Cogn Sci 2006;10:182-191.
5-HIIA: ácido 5-hidroxi-indolacético; PBMC: Periferical Blood 22. Boyce-Rustay JM, Wiedholz LM, Millstein RA, Carroll J et al. Ethanol- related behaviors in serotonin transporter knockout mice. Alcohol Clin Mononuclear Cells (Células Mononucleares de Sangre Periférica); SSI: Solución Salina Isotónica; GADPH: Gliceraldheído 3-fosfato 23. Cornelius JR, Salloum IM, Ehler JG, Jarrett PJ et al. Fluoxetine in depres- Deshidrogenasa; cDNA: DNA complementario; DNA: Ácido sed alcoholics. A double-blind, placebo-controlled trial. Arch Gen Desoxirribonucleico; RNA: Ácido Ribonucleico; PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa; RT-PCR: Retro-Transcriptasa Reacción en 24. Moak DH, Anton RF, Latham PK, Voronin KE et al. Sertraline and cog- nitive behavioral therapy for depressed alcoholics: results of a placebo-controlled trial. J Clin Psychopharmacol 2003;23:553-562.
25. Naranjo CA, Sellers EM, Sullivan JT, Woodley DV et al. The serotonin uptake inhibitor citalopram attenuates ethanol intake. Clin PharmacolTher 1987;41:266-274.
1. World Health Organization. Global Status Report on Alcohol 2004. Swit- 26. Naranjo CA, Kadlec KE, Sanhueza P, Woodley-Remus D et al. Fluoxeti- ne differentially alters alcohol intake and other consummatory beha- 2. Fleiz C, Borges G, Rojas E, Benjet C et al. Uso de alcohol, tabaco y dro- viors in problem drinkers. Clin Pharmacol Ther 1990;47:490-498.
gas en población mexicana, un estudio de cohortes. Salud Mental 27. Naranjo CA, Poulos CX, Bremner KE, Lanctot KL. Citalopram decrea- ses desirability, liking, and consumption of alcohol in alcohol-depen- 3. Consejo Nacional Contra las Adicciones, Instituto Nacional de Psiquia- dent drinkers. Clin Pharmacol Ther 1992;51:729-739.
tría Ramón de la Fuente, Instituto Nacional de Salud Pública, Funda- 28. Roy-Byrne PP, Pages KP, Russo JE, Jaffe C et al. Nefazodone treatment ción Gonzalo del Rio Aronte IAP. Encuesta Nacional de Adicciones 2008.
of major depression in alcohol-dependent patients: a double-blind, pla- cebo-controlled trial. J Clin Psychopharmacol 2000;20:129-136.
4. Yaldizli O, Kuhl HC, Graf M, Wiesbeck GA et al. Risk factors for suicide 29. Lima L, Urbina M. Serotonin transporter modulation in blood lympho- attempts in patients with alcohol dependence or abuse and a history of cytes from patients with major depression. Cell Mol Neurobiol depressive symptoms: a subgroup analysis from the WHO/ISBRA stu- 30. Sheng M, Kim MJ. Postsynaptic signaling and plasticity machanisms.
5. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM. Principles of neural science. Cua- tra edición. USA: United Satates of America Press; 2000.
31. Vicente-Manzanares M, Sánchez-Madrid F. Role of the cytoskeleton 6. Vengeliene V, Bilbao A, Molander A, Spanagel R. Neuropharmacology during leucocyte responses. Nat Rev Immuol 2004;4:110-122.
of alcohol addiction. Br J Pharmacol 2008; 154:299-315.
32. Levite M. Neurotransmitters activate T-cells and elicit crucial functions 7. Heinz A, Goldman D, Gallinat J, Schumann G et al. Pharmacogenetic via neurotransmitter receptors. Curr Opin Pharmacol 2008;8:460-471.
insights to monoaminergic dysfunction in alcohol dependence. Psycho- 33. Faraj BA, Olkowski ZL, Jackso RT. Prevalence of high serotonin uptakein pharmacology (Berl) 2004;174:561-570.
in limphocytes of abstinent alcoholics. Biochem Pharmacol 1997;53:53-57.
Expresión del mensaje genético del transportador de serotonina en pacientes con dependencia al alcohol 34. Rausch JL, Monteiro MG, Schuckit MA. Platelet serotonin uptake in men 42. Latvala J, Parkkila S, Niemela O. Excess alcohol consumption is com- with family histories of alcoholism. Neuropsychopharmacology mon in patients with cytopenia: studies in blood and bone marrow ce- lls. Alcohol Clin Exp Res 2004;28:619-624.
35. Heinze G. Mini International Neuropsychiatric Interview. Sheehan DV, 43. Heinz A, Ragan P, Jones DW, Hommer D et al Reduced central seroto- Lecrubier Y (eds.). Spanish South and Central America version/DSM- nin transporters in alcoholism. Am J Psychiatry 1998;155:1544-1549.
44. Tsao CW, Lin YS, Chen CC, Bai CH et al. Cytokines and serotonin trans- 36. Solis L, Cordero M, Cordero R, Martínez M. Caracterización del nivel porter in patients with major depression. Prog Neuropsychopharmacol de dependencia al alcohol entre habitantes de la Ciudad de México. Salud 45. Greenberg BD, Tolliver TJ, Huang SJ, Li Q et al. Genetic variation in the 37. Rio DC, Ares M Jr, Hannon GJ, Nilsen TW. Purification of RNA using serotonin transporter promoter region affects serotonin uptake in hu- TRIzol (TRI reagent). New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pres- man blood platelets. Am J Med Genet 1999;88:83-87.
46. Kranzler H, Lappalainen J, Nellissery M, Gelernter J. Association study 38. Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, Clark BJ. GAPDH as a house- of alcoholism subtypes with a functional promoter polymorphism in keeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 the serotonin transporter protein gene. Alcohol Clin Exp Res human tissues. Physiol Genomics 2005;21:389-395.
39. Stamova BS, Apperson M, Walker WL. Identification and validation of 47. Lesch KP, Bengel D, Heils A, Sabol SZ et al Association of anxiety-rela- suitable endogenous reference genes for gene expression studies in hu- ted traits with a polymorphism in the serotonin transporter gene regu- man peripheral blood. BMC Med Genomics 2009;2:49.
latory region. Science 1996;274:1527-1531.
40. Ross R, Kumpf K, Reske-Kunz AB. PCR-amplified cDNA probes for veri- 48. Kranzler HR, Rosenthal RN. Dual diagnosis: alcoholism and co-morbid fication of differentially expressed genes. Biotechniques 1997;22:894-897.
psychiatric disorders. Am J Addict 2003;12(Suppl 1):S26-S40.
41. Yang GB, Qiu CL, Aye P, Shao Y et al. Expression of serotonin transpor- 49. Javors M, Tiouririne M, Prihoda T. Platelet serotonin uptake is higher in ters by peripheral blood mononuclear cells of rhesus monkeys (Macaca early-onset than in late-onset alcoholics. Alcohol Alcohol 2000;35:390-393.
mulatta). Cell Immunol 2007;248:69-76.

Source: http://www.alcoholinformate.com.mx/sm3402139.pdf