Harmita030

REVIEW ARTIKEL
Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 - 135 PETUNJUK PELAKSANAAN VALIDASI
METODE DAN CARA PERHITUNGANNYA
ABSTRACT
Each analysis method by some reason, must be validated. The parameters are selectivity, accuracy, precision, linearity, LOD, LOQ, ruggedness, and robustness. The parameters need to be calculated by assay methods. This paper try to give some information above these methods base on some literatures (USP 23rd, WHO, journal, etc). Key words : Validation method, Parameter, Assay and calculation methods. VALIDASI METODA ANALISIS
Validasi metoda analisis adalah sebagai persen perolehan kembali suatu tindakan penilaian terhadap (recovery) analit yang ditambahkan.
parameter tertentu, berdasarkan Kecermatan hasil analis sangat ter- percobaan laboratorium, untuk mem- gantung kepada sebaran galat siste- buktikan bahwa parameter tersebut matik di dalam keseluruhan tahapan memenuhi persyaratan untuk peng- analisis. Oleh karena itu untuk men- PARAMETER PENAMPILAN
ANALISIS
Beberapa parameter analisis suhu, dan pelaksanaannya yang yang harus dipertimbangkan dalam cermat, taat asas sesuai prosedur.
1. Kecermatan (accuracy)
(spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition Kecermatan adalah ukuran yang method). Dalam metode simulasi, se- menunjukkan derajat kedekatan hasil jumlah analit bahan murni (senyawa REVIEW ARTIKEL
pembanding kimia CRM atau SRM) analit yang ditambahkan tadi dapat ditambahkan ke dalam campuran ditemukan.
(plasebo) lalu campuran tersebut tergantung kepada konsentrasi analit dianalisis dan hasilnya dibandingkan dalam matriks sampel dan pada dengan kadar analit yang ditam- keseksamaan metode (RSD). Vander- bahkan (kadar yang sebenarnya). wielen, dkk menyatakan bahwa se- Dalam metode penambahan baku, lisih kadar pada berbagai penentuan sampel dianalisis lalu sejumlah ter- (X ) harus 5% atau kurang pada tentu analit yang diperiksa ditam- setiap konsentrasi analit pada mana bahkan ke dalam sampel dicampur prosedur dilakukan. Harga rata-rata dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil selisih secara statistik harus 1,5% atau dibandingkan dengan kadar yang kurang. Kriteria tersebut dinyatakan sebenarnya (hasil yang diharapkan). secara matematik sebagai berikut: Tetapi bila tidak memungkinkan X = hasil analisis membuat sampel plasebo karena X = hasil yang sebenarnya matriksnya tidak diketahui seperti I = nilai t pada tabel t’ student pada litnya berupa suatu senyawa endo- S = simpangan baku relatif dari pada kultur kalus, maka dapat di- n = jumlah sampel yang dianalisis dengan menambahkan sejumlah penambahan baku dapat dihitung analit dengan konsentrasi tertentu sebagai berikut: REVIEW ARTIKEL
S = kadar analit yang ditambahkan Analit pd matrik % Perolehan kembali = x 100 0,000.01 (100 ppb) C = konsentrasi total sampel yang 0,000.000.1 (1 ppb) C* = konsentrasi analit yang di- Contoh perhitungan: Perolehan kembali Analit
Pada metode penambahan baku, Dianggap bobot tiap tablet 175 mg.
lagi. Metode ini tidak dapat diguna- Penimbangan 20 tablet : 20 x 175 mg kan jika penambahan analit dapat = 3500 mg.
analit yang ditambahkan menyebab- Komposisi tablet tdd :
pH atau kapasitas dapar, dll. Kriteria Zat aktif : 20 x 7,5 mg = 150 mg Pada percobaan penetapan ke- 3500 mg – 150 mg = 3350 mg cermatan, sedikitnya lima sampel Penimbangan serbuk plasebo: yang mengandung analit dan plaseo 3.364,791 mg ditambahkan dengan yang harus disiapkan dengan kadar Meloksikam: 151,043 mg = 3.515,834 Persen perolehan kembali seha- Meloksikam yg ditambahkan: rusnya tidak melebihi nilai presisi 151,043 x 99,34% = 150,046 mg
REVIEW ARTIKEL
PEROLEHAN KEMBALI 80, 100
Perbandingan yang digunakan untuk 99,34 % = 29,929 mg, larutkan dalam spike placebo : baku yang ditambah- metanol 100 ml metanol. Pipet 5 ml Terdiri dari serbuk plasebo = 70/100 Contoh perhitungan % Perolehan
serbuk plasebo = 2,24/150,05 x 1712875 + 1718115 Penimbangan baku : 9,664 mg x 99,34 1715495 + 3282,9347 = 3,234 mg (C )
Terdiri dari serbuk plasebo = 70/100 53,215 mg serbuk plasebo = 2,80 /150,05 0,96 mg (C* ) % Baku = 30/100 x 4 mg = 1,2 mg Dalam 53,215 mg serbuk plasebo Penimbangan baku : 24,315 mg x terdapat meloksikam sebanyak : metanol 100 ml metanol. Pipet 5 ml 53,215 / 3515,834 x 150,046 mg = 2,271 serbuk plasebo = 3,36 /150,05 3,234 – 2,271 x 100 % = 100,31 % REVIEW ARTIKEL
METODE SPIKED PLACEBO RE- Rata rata luas puncak piroksikam :
79,615 mg (99,34%) meloksikam ! Kadar meloksikam = labu tentukur 200ml. Larutkan dalam 1,3499211 - 0,01700 x 50 = 3,852mg metanol. Ultrasonik selama 30 menit. 0,0173 1000 Pipet 2, 4, 6, 10 dan 15 ml larutan ! 92,053 mg mengandung 2 ml larutan baku dalam. Tambahkan 92,053 x 150,046 = 3,92857 mg 2. Keseksamaan (precision)
Persamaan regresi : y = 0,0173 x + suaian antara hasil uji individual, Rata rata luas puncak meloksikam : sampel-sampel yang diambil dari Tabel 1. Hasil pengukuran kurva kalibrasi meloksikam menggunakan baku dalam
REVIEW ARTIKEL
Keseksamaan diukur sebagai dengan menurunnya konsentrasi simpangan baku atau simpangan analit. Pada kadar 1% atau lebih, baku relatif (koefisien variasi). Ke- standar deviasi relatif antara labo- seksamaan dapat dinyatakan sebagai ratorium adalah sekitar 2,5% ada keterulangan (repeatability) atau pada satu per seribu adalah 5%. Pada ketertiruan (reproducibility). Keter- kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya ulangan adalah keseksamaan metode adalah 16%, dan pada kadar part per jika dilakukan berulang kali oleh bilion (ppb) adalah 32%. Pada me- analis yang sama pada kondisi sama tode yang sangat kritis, secara umum dan dalam interval waktu yang diterima bahwa RSD harus lebih dari pendek. Keterulangan dinilai melalui 2%.
kap terhadap sampel-sampel identik fungsi penetapan kadar pada rentang yang terpisah dari batch yang sama, yang dapat diterima menurut De- jadi memberikan ukuran keseksama- besis et. al. pada analisa mengguna- an pada kondisi yang normal. Keter- kan metode HPLC akan digunakan tiruan adalah keseksamaan metode ketentuan presisi berikut: (lihat tabel jika dikerjakan pada kondisi yang 2 di sebelah).
dalam laboratorium-laboratorium campuran dan bahan sisa pada artikel yang berbeda menggunakan pera- obat, formula berikut ini harus di- latan, pereaksi, pelarut, dan analis gunakan untuk menentukan metode yang berbeda pula. Analis dilakukan ketertiruan yang tepat (interlabo- terhadap sampel-sampel yang di- ratorium).
duga identik yang dicuplik dari batch dilakukan dalam laboratorium yang dan untuk keterulangan : beda. Kriteria seksama diberikan jika c = konsentrasi analit sebagai fraksi sangat fleksibel tergantung pada dengan cara sebagai berikut: konsentrasi analit yang diperiksa, 1. Hasil analisis adalah x , x , x , x REVIEW ARTIKEL
Tabel 2. Rentang maksimum yang diperbolehkan (Perhitungan dibuat berdasarkan
atas kepercayaan 99%).
yang homogen. Sebaiknya kesek- Standar 1000 ppm sebenarnya yaitu berupa campuran - Timbang 50,0 mg tetrasiklin HCl.
harus disiapkan sampel untuk meng- - Pipet 5,0 ml larutan diatas. Ma- Contoh uji homogenitas
- Timbang 25,0 mg tetrasiklin HCl. dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit Masukan kedalam labu ukur 50,0 dan panjang gelombang 360 nm.
REVIEW ARTIKEL
Tabel 3. Homogenitas dari Tetrasiklin HCl
Contoh perhitungan uji keseksama-
an (presisi)
20,0; 30,0 mg masing-masing ma- - Suntikan 20 µl larutan uji pada an berturut-turut sebesar 400, 500 Presisi dilakukan pada sediaan - Larutkan dengan air sampai 50,0 konsentrasi 80 %, 100 %, 120 % kadar - Suntikkan µl larutan baku pada enam kali penimbangan yang dilaku- - Timbang serbuk obat Tetrasiklin dapat dilihat pada tabel-tabel berikut REVIEW ARTIKEL
Tabel 4. Presisi Tetrasiklin 80 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 Tabel 5. Presisi Tetrasiklin HCl 100 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 Tabel 6. Presisi Tetrasiklin HCl 120 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 REVIEW ARTIKEL
Tabel 7. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 Tabel 8. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 100 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 Tabel 9. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 120 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 REVIEW ARTIKEL
Tabel 10. Persisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %
SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 3. Selektivitas (Spesifisitas)
pakan selisih dari hasil uji keduanya.
suatu metode adalah kemampuannya dapat diidentifikasi atau tidak dapat yang hanya mengukur zat tertentu diperoleh, maka selektivitas dapat saja secara cermat dan seksama ditunjukkan dengan cara menga- dengan adanya komponen lain yang nalisis sampel yang mengandung mungkin ada dalam matriks sampel. cemaran atau hasil uji urai dengan Selektivitas seringkali dapat dinyata- metode yang hendak diuji lalu diban- kan sebagai derajat penyimpangan dingkan dengan metode lain untuk (degree of bias) metode yang dilakukan pengujian kemurnian seperti kroma- terhadap sampel yang mengandung tografi, analisis kelarutan fase, dan bahan yang ditambahkan berupa Differential Scanning Calorimetry.
cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, Derajat kesesuaian kedua hasil ana- senyawa asing lainnya, dan diban- lisis tersebut merupakan ukuran dingkan terhadap hasil analisis sam- selektivitas. Pada metode analisis pel yang tidak mengandung bahan yang melibatkan kromatografi, selek- Selektivitas metode ditentukan Cara kerja :
lisis sampel yang mengandung cema- yang akan diuji harus ditentuka dulu ran, hasil urai, senyawa sejenis, se- panjang gelombang maksimum.
nyawa asing lainnya atau pembawa Dalam hal ini larutan tetrasiklin HCl plasebo dengan hasil analisis sampel mempunyai panjang gelombang tanpa penambahan bahan-bahan tadi. maksimum 360 nm. Selanjutnya REVIEW ARTIKEL
dibuat larutan baku, larutan uji dan matik yang baik, proporsional ter- a. Pembuatan larutan baku tetra- sampel. Rentang metode adalah - Timbang 25,0 mg baku Tetrasiklin tertinggi analit yang sudah ditun- HCl, masukan kedalam labu ukur jukkan dapat ditetapkan dengan - Larutkan dengan air sampai 50,0 linearitas yang dapat diterima.
b. Pembuatan larutan uji tetrasiklin sarkan persamaan matematik data - Timbang 100,0 mg serbuk obat dalam sampel dengan berbagai kon- tetrasiklin HCl, masukan kedalam sentrasi analit. Perlakuan matematik - Larutkan dengan air sampai 100,0 melalui persamaan garis lurus - Saring dengan kertas saring tara hasil analisis terhadap konsen- Durapore membrane filter 0,45 trasi analit. Dalam beberapa kasus, - Suntikan 20 µl larutan uji pada porsional antara hasil pengukuran HPLC. Amati puncaknya pada dengan konsentrasi analit, data yang Hasil kromatogram Tetrasiklin HCl analisis regresinya.
jukkan waktu retensi yang sama dan seri larutan yang berbeda konsen- pada daerah sekitar waktu retensi trasinya antara 50 – 150% kadar analit tetrasiklin tersebut tidak boleh ada dalam sampel. Di dalam pustaka, gangguan yang dapat dilihat dari sering ditemukan rentang konsen- 4. Linearitas dan Rentang
metode analisis yang memberikan bungan linier digunakan koefisien respon yang secara langsung atau korelasi r pada analisis regresi linier dengan bantuan transformasi mate- Y = a + bX. Hubungan linier yang REVIEW ARTIKEL
ideal dicapai jika nilai b = 0 dan Standar 1 : garis. Sedangkan nilai a menun- Masukan kedalam labu ukur 10,0 ml.
jukkan kepekaan analisis terutama Tambahkan air sampai 10,0 ml, instrumen yang digunakan. Param- kocok.
eter lain yang harus dihitung adalah Standar 2 : Dengan menggunakan kalkulator Masukkan ke dalam labu ukur 25,0 atau perangkat lunak komputer, ml. Tambahkan air sampai 25,0 ml, semua perhitungan matematik ter- kocok.
Vx = koefisien variasi dari fungsi Tambahkan air sampai 10,0 ml, Contoh penentuan linearitas
Cara kerja :
a. - Timbang baku tetrasiklin HCl Standar 9 : Larutan baku B2 (B1, B2, B3) masing-masing Standar 10 : Larutan baku B3 Masukkan kedalam labu ukur dengan standar 10 pada HPLC pada - Larutkan dengan air sampai ml/menit. Hubungan linear antara b. - Timbang baku Tetrasiklin HCl siklin HCl dalam pelarut air pada 10 (B4, B5) masing-masing sebe- perbedaan tingkat konsentrasi antara sar 30,0; 35,0 mg. Masukkan 100 – 1000 ppm ditunjukkan pada - Larutkan dengan air sampai menggunakan model y = ax + b dapat REVIEW ARTIKEL
Tabel 11. Linearitas dari Tetrasiklin HCl
5. Batas Deteksi dan Batas Kuan- kan instrumen atau tidak. Pada
Batas deteksi adalah jumlah ter- dengan mendeteksi analit dalam kecil analit dalam sampel yang dapat sampel pada pengenceran bertingkat.
dideteksi yang masih memberikan Pada analisis instrumen batas deteksi respon signifikan dibandingkan dapat dihitung dengan mengukur dengan blangko. Batas deteksi me- respon blangko beberapa kali lalu rupakan parameter uji batas. Batas dihitung simpangan baku respon kuantitasi merupakan parameter blangko dan formula di bawah ini pada analisis renik dan diartikan dapat digunakan untuk perhitungan metode berbeda-beda tergantung k = 3 untuk batas deteksi atau 10 REVIEW ARTIKEL
S = simpangan baku respon analitik a. Batas deteksi (Q) dapat dihitung secara statistik b. Batas kuantitasi (Q) Perhitungan LOD dan LOQ
Tabel 12. Hasil pengukuran Kurva Kalibrasi Meloksikam
Persamaan regresi ; y = 26569,95 x – 3282,9347 REVIEW ARTIKEL
Y didapat dari pers regresi, misalnya: 6. Ketangguhan metode (rugged-
ness)
S (y/x)2 = Variasi variabel respon (y), sama dalam berbagai kondisi uji nor- didapat dari data-data yang dekat mal, seperti laboratorium, analisis, atau lingkungan kerja pada hasil uji.
= 2,19 µg/ml yang berbeda, dan lingkungan yang Cara lain untuk menentukan sedur dan parameter uji yang sama.
batas deteksi dan kuantitasi adalah Derajat ketertiruan hasil uji kemu- melalui penentuan rasio S/N (signal dian ditentukan sebagai fungsi dari to noise ratio). Nilai simpangan baku variabel penentuan. Ketertiruan blanko ditentukan dengan cara dapat dibandingkan terhadap kesek- menghitung tinggi derau pada peng- samaan penentuan di bawah kondisi ukuran blanko sebanyak 20 kali pada normal untuk mendapatkan ukuran titik analit memberikan respon. Sim- ketangguhan metode. Perhitung- pangan baku blanko juga dihitung annya dilakukan secara statistik dari tinggi derau puncak ke puncak, menggunakan ANOVA pada kajian jika diambil dari tinggi puncak kolaboratif yang disusun oleh cak derau bawah saja (puncak negatif) 7. Kekuatan (Robustness)
REVIEW ARTIKEL
metodologi yang kecil dan terus bergantung pada tipe prosedur ana- menerus dan mengevaluasi respon litik. Metode yang digunakan untuk analitik dan efek presisi dan akurasi. pemeriksaan produk farmasetika Sebagai contoh, perubahan yang di- dapat diklasifikasikan seperti di butuhkan untuk menunjukkan keku- bawah ini : atan prosedur HPLC dapat mencakup ! Kategori I : metode analitikal un- bahan temperatur kolom (± 2 - 3° C).
Identifikasi sekurang-kurangnya ! Kategori II : Metode analitik untuk yang telah disebutkan pada peme- ! Kategori III : Metode analitik ini Untuk menentukan efek peru- parameter analitik yang biasanya bahan A, banding rata-rata hasil (#1 diperlukan untuk masing-masing + #2)/2 dengan (#3 + #4)/2, Untuk kategori.
#3)/2 dengan (#2 +#4)/2 dan sete- Tes SST (system suitability tests) SELEKSI PARAMETER
ANALITIK
Parameter analitik yang diper- suatu kondisi tertentu. Untuk lukan untuk validasi dapat bervariasi mengetahui apakah metode tadi REVIEW ARTIKEL
Tabel 13. Parameter analitik yang harus dipertimbangkan untuk tipe prosedur analitik
yang berbeda
* mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik.
masih dapat dipakai, seyogyanya Fabre. H. et.al., Assay validation for khusus untuk kromatografi param- Garfield, F.M. Quality Assurance eter tailing factor dan column effi- ciency/ plate count juga diuji.
DAFTAR PUSTAKA
Pharmaceutical and Biomedical Indrayanto G, Seminar Sehari Instru- methodes to the compendia and Siregar, Mirawati., Penetapan Kadar REVIEW ARTIKEL
Departemen Farmasi FMIPA-UI, Validation of Compendial Methods.

Source: http://tiwi.community.undip.ac.id/files/2010/05/Harmita0103011.pdf